Les études structurales des protéines membranaires eucaryotes sont importantes mais particulièrement difficiles à effectuer car elles nécessitent non seulement un système efficace et pratique pour produire la protéine dans une conformation native, d’une technique d’étude structurale compatible avec ce dernier. Du fait de leur modularité, les systèmes de production acellulaires in vitro sont adaptés à la production de protéines membranaires. De plus, l’amélioration de leur robustesse et de leur efficacité les rendent maintenant comme une alternative viable à l’expression cellulaire. Parmi ceux-ci, le Système d’Expression Acellulaire à partir de Germes de Blé (SEA-GB) est le plus efficace pour produire des protéines membranaires eucaryotes, et permet de plus un marquage isotopique efficace et spécifique. Ce dernier point est très utile pour la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), et plus spécifiquement la RMN du solide qui permet l’étude structure de protéines membranaires et d’assemblages macromoléculaires. Depuis récemment, la RMN du solide est compatible avec le SEA-GB, formant un outil puissant pour l’étude structurale de protéines membranaires et assemblages macromoléculaires. Dans ces travaux, les deux techniques ont été combinées pour la production et l’étude des protéines d’enveloppe du virus de l’Hépatite B du canard (VHBC), appartenant à la famille des Hepadnaviridae. Ces virus sont capables de sécréter des virions actifs, mais aussi des particules composées uniquement de protéines d’enveloppe, appelées particules sous-virales (PSV). Dans un premier temps, nous montrons que plusieurs milligrammes de petite protéine d’enveloppe (DHBs S) du VHBC sont produits sous forme soluble avec le SEA-GB. DHBs S forme des PSV durant la traduction, ce qui confirme la conformation native de la protéine. Après désassemblage des PSV, la protéine est majoritairement en hélice , synonyme d’un bon repliement. Après isolation par ultracentrifugation sur gradient de sucrose, les PSV ont été sédimentées dans un rotor de 0.7 mm et étudiées par RMN du solide. Des spectres 2D hNH très prometteurs ont été obtenus, avec un bon signal, des pics isolés et une résolution similaire à celle d’autres protéines membranaires sédimentées et étudiées par RMN du solide. De plus, la superposition du spectre de DHBs S avec des spectres simulés de protéines modèles possédant des structures secondaires caractéristiques confirme que DHBs S est principalement en hélice dans le contexte des PSV. Le signal doit cependant être amélioré pour pouvoir réaliser les expériences nécessaires à des études structurales approfondies, c’est pourquoi des tests d’optimisation de la production ont été effectués. D’une part, l’amélioration du rendement de production, via l’utilisation d’un extrait de germes de blé commercial, et de la stabilisation des PSV, par incubation avec du KSCN, ont été testés. D’autre part, différentes méthodes de purification ont été examinées: précipitation à l’ammonium sulfate ou au PEG6000, incubation à haute température, élimination de contaminants via une unité d’ultrafiltration, purification d’affinité ou d’exclusion stérique ainsi qu’un test de désassemblage des particules, suivie d’une purification puis de la reconstitution des PSVs en présence de lipides. Enfin, un marquage isotopique spécifique de certains acides aminés a été évalué. Dans la seconde partie, nous avons étendu les possibilités du SEA-GB via l’expression de la grande protéine d’enveloppe (DHBs L) du VHBC. In vivo, la protéine est phosphorylée spécifiquement et subit aussi une traduction alternative ; nous avons montré que c’était aussi le cas dans le SEA-GB. Nous avons aussi testé la coexpression de DHBs S, DHBs L ainsi que de la capside de DHBV pour inclure DHBs L dans les PSV, voire même reconstituer des virions entiers, ce qui augmenterait les possibilités du système. Enfin, nous avons aussi détaillé certains paramètres critiques pour la formation des PSV dans le système

Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont de petits modules génétiques largement présents dans les génomes bactériens. Ils codent pour une petite protéine toxique et une antitoxine. Ils sont classés en six types en fonction de la nature et du mode d'action de l'antitoxine. Ce travail a porté sur l'étude du type I, pour lequel l'antitoxine est un ARN antisens qui cible l'ARNm de la toxine afin de réprimer son expression. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le système aapA3/IsoA3, codé sur le chromosome du pathogène gastrique humain Helicobacter pylori. À ce jour, la plupart des systèmes TA ont été étudiés à l'aide de systèmes d'expression artificiels, qui ne permettent pas de caractériser la régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle. En utilisant la létalité induite par l’expression chromosomique de la toxine obtenue en absence d’antitoxine, nous avons développé une sélection génétique de mutants suppresseurs révélés par séquençage haut-débit. Cette approche, appelée FASTBAC-Seq, nous a permis de cartographier une myriade de déterminants de toxicité localisés dans les régions codantes et non codantes du gène de la toxine AapA3. En particulier, certaines de ces mutations ont révélé l'existence de tige-boucles ARN transitoires qui agissent de manière co-transcriptionnelle pour empêcher l'initiation de la traduction pendant la synthèse de l'ARNm codant pour la toxine. Ces structures ARN métastables fonctionnelles sont nécessaires pour découpler les processus de transcription et de traduction et permettent la présence de ces gènes toxiques sur le chromosome bactérien. Bien que les ARNm non traduits deviennent rapidement instables, nos travaux ont également révélé l'existence de deux tige-boucles protectrices situées aux deux extrémités de l'ARNm. Ces structures secondaires empêchent des activités exonucléolytiques agissant en 5' et 3'. Dans l’ensemble, notre travail met en évidence les conséquences de la forte pression de sélection pour limiter l'expression des toxines sous laquelle évoluent les systèmes TA. Cela nous a permis de mieux comprendre l’influence du repliement secondaire des ARNm, non seulement lors de la régulation posttranscriptionnelle, mais aussi co-transcriptionnelle de l’expression de cette famille particulière de gènes. Ces caractéristiques de régulation basées sur l'ARN peuvent être exploitées à l'avenir pour des applications biotechnologiques (p. ex., production accrue de protéines par stabilisation d'ARNm) ou biomédicales (p.ex., développement de stratégies antimicrobiennes alternatives pour l'activation de la synthèse de toxines).

Le protéasome 20S constitue le coeur catalytique du protéasome 26S, composant majeur du système de dégradation ATP/ubiquitine dépendant qui assure la dégradation de nombreuses protéines cellulaires et constitue la source majeure de peptides antigéniques de classe I. 'immunoprotéasome diffère du protéasome standard au niveau des 3 sous- unités catalytiques. L'incorporation des 3 ±immuno-sous-unitésα, longtemps considérée comme orientant le protéasome vers la génération de peptides antigéniques de classe I, peut cependant être défavorable à la génération de certains peptides antigéniques d'origine tumorale. L'étude de la maturation différentielle de plusieurs peptides d'origine tumorale (MelanA-A2, tyrosinase-A2, gp100-A2, MAGE3-B60) par le protéasome standard et l'immunoprotéasome a donc été entreprise par æLC-MS/MS. L'identification et la quantification des peptides générés par le protéasome à partir de précurseurs peptidiques ont mis en évidence une maturation préférentielle du peptide antigénique MAGE3-B60 par l'immunoprotéasome et des trois autres peptides antigéniques par le protéasome standard. . .

Les mitochondries sont au cœur de la bioénergétique eucaryote. L'étude de l'expression et de l'évolution du génome mitochondrial (mt) est fondamentale pour comprendre la conversion de l'énergie cellulaire. Plusieurs organismes modèles sont largement utilisés pour étudier l'expression du gène mt, en particulier Homo sapiens, Saccharomyces cerevisiae, Trypanosoma brucei, Arabidopsis thaliana et Chlamydomonas reinhardtii. Cette dernière est une algue verte unicellulaire de la lignée des chlorophytes, utilisée dans le monde entier pour la recherche sur la motilité flagellaire, la photosynthèse, la production de biocarburants et la biogenèse des organites. Le génome de Chlamydomonas mt1 est remarquable à bien des égards. D'une part, il partage des caractéristiques des plantes supérieures telles que l'utilisation d'un code génétique universel ou la perte de nombreux gènes d'ARNt2, mais d'autre part, il partage plus de similitudes avec les génomes mt de mammifères3 : il est petit, compact et exprimé comme deux transcrits primaires qui sont clivés post-transcriptionnellement pour générer des ARNm monocistroniques, des ARNt et des ARNr. De plus, comme récemment démontré, les ARNm mt de Chlamydomonas possèdent des caractéristiques remarquables6. (i) Tous les ARNm matures manquent d'une région non traduite en 5 '(UTR) et les transcrits commencent directement au codon d'initiation AUG. Cette caractéristique est partagée avec les ARNm mt de mammifères et implique que l'initiation de la traduction se produit indépendamment d'un site de liaison au ribosome en amont. (ii) Les ARNm de Chlamydomonas mt possèdent des queues ajoutées après la transcription à la fin de leur court 3'-UTR. La plupart de ces queues sont principalement composées de résidus de cytidine, contrairement aux queues polyA/U trouvées dans d'autres mitochondries. La polycytidylation semble être une caractéristique des Chlorophycées, un groupe d'algues vertes. De plus, comme dans les mitochondries de mammifères, le génome de Chlamydomonas mt ne code pas pour un ARNr 5S. De manière frappante, ses ARN ribosomiques sont fragmentés en 14 morceaux de gène (4 pour la petite sous-unité (SSU) et 10 pour les ARNr de la grande sous-unité (LSU))5. Cela soulève de nombreuses questions sur la structure et l'assemblage des mitoribosomes de Chlamydomonas. Nous avons récemment obtenu les premières données protéomiques et une structure préliminaire à une résolution de 6-7Å du mitoribosome de Chlamydomonas (Fig. 1). Cela révèle des caractéristiques structurelles uniques et une composition protéique qui diffère considérablement de celle de tous les autres mitoribosomes connus, y compris le mitoribosome de plante terrestre. En particulier, des domaines d'ARNr supplémentaires et manquants par rapport à d'autres mitoribosomes et de nombreuses protéines à répétition hélicoïdale (HRP) non identifiées jusqu'à présent ont été observés. Sur la base de ces solides connaissances, notre projet vise à caractériser l'appareil de traduction mitochondriale de l'algue modèle Chlamydomonas et à comprendre comment son activité est liée à la maturation des ARNm.

Traductologie et traduction : Problématique des Transferts culturels de l'allemand vers l'arabe dans les traductions des œuvres de Böll. Nos recherches porteront sur des phénomènes linguistiques et des transferts culturels de la traduction littéraire de l'allemand vers le monde Arabe, en particulier les œuvres de Heinrich Böll. Nous nous intéresseront à des phénomènes linguistiques du texte source allemand qui peuvent poser des problèmes de compréhensions et éventuellement des faux sens et contre sens de traduction et sur un autre plan les difficultés linguistico-pragmatiques qui incluent la problématique du lien entre phénomènes linguistiques et phénomènes culturels qui incluent aussi les problèmes du back-ground culturel implicite, les présupposés et sous-entendus.